Микробиология, понятие микробиологии, статьи по микробиологии, микробиологические процессы

Апрель 2011

Если на матричной чашке имеется рост отдельных колоний, то путем переноса их на различные селективные среды можно отобрать соответствующие мутанты. Метод реплик используют для отбора ауксотрофных мутантов. При этом культуру прототрофа засевают на полноценную среду с таким расчетом, чтобы на чашке вырастало 100 200 колоний. С такой (матричной) чашки производят отпечатки на глюкозосолевую среду (первая реплика) и на полноценную среду (вторая реплика). При этом точно фиксируется место расположения колоний (54). Колонии, не выросшие на минимальной среде, но выросшие на полноценном агаре, изолируют и изучают их потребности в питательных веществах. Культуры из таких колоний обычно являются ауксотрофами, неспособными синтезировать то или иное жизненно необходимое соединение.

Результаты опыта Ньюкомба представлены на 53. Они показывают, что перераспределение значительно увеличивает число колоний фагорезистентных клеток. Следовательно, фагорезистентные мутанты образуются до контакта бактерий с фагом.
Весьма наглядным методом доказательства случайного возникновения мутантов в бактериальной культуре является косвенный отбор, осуществленный с помощью метода отпечатков или реплик. Этот метод позволяет отобрать бактерии, резистентные к любому агенту, совсем не подвергая их воздействию какого либо мутагенного агента. Метод очень прост. На деревянном или металлическом цилиндре, диаметр которого несколько меньше диаметра чашки Петри, закрепляется бархат. Если ворсистой поверхностью бархата легко прикоснуться к колониям, выросшим на чашке Петри, а затем этой же поверхностью прикоснуться к чашке со средой, то таким путем можно осуществить пересев колоний. Этот пересев можно произвести на ряд чашек, поочередно прикасаясь ими к поверхности бархата. Чашку, с которой производится пересев, называют матричной, чашки, на которые пересеваются колонии, репликами.

В результате опытов было установлено, что возникновение мутантов не связано с обработкой фагом. В высевах из различных пробирок количество колоний фагорезистентных бактерий резко варьировало (наблюдалась флюктуация). При высевах же из одной пробирки, содержащей большее количество культуры, вырастало примерно равное количество колоний.
Эти данные позволили заключить, что формирование фагорезистентных бактерий не связано с воздействием бактериофага и происходит в не обработанной фагом культуре случайно относительно времени.
Аналогичные результаты были получены в опытах Ньюкомба. Он засевал на чашки с агаром, не содержащие фага, чувствительную к фагу культуру кишечной палочки и инкубировал эти чашки 5 б часов в термостате. В это время засеянные бактерии осуществляли несколько делений и образовывали микроколонии. Затем производился перерассев популяции. С этой целью поверхность чашки растирали шпателем и на чашки наносили суспензию фага. Контрольные чашки обрабатывали бактерофагом без предварительного перераспределения выросших бактерий. Цель растирания микроколоний в опытных чашках была следующая. Бели в засеянной культуре находятся мутантные клетки либо нутантны возникают в начале роста бактерий, то к моменту перераспределения они, как и прочие клетки, размножаются и образуют микроколонии. Клетки такой колонии будут мутантные, т. е. резистентные к бактериофагу. Если выросшие колонии перерассеять, то составляющие их мутантные клетки распределятся по поверхности чашки и дадут начало новым колониям мутантных клеток. Следовательно, в результате перераспределения число вырастающих фагорезистентных колоний должно быть значительно большим по сравнению с чашками, на которых перераспределения не производилось.

При этом предполагалось, что если устойчивые особи возникают в результате контакта бактерий с фагом, то условия их предварительного культивирования (до высева на чашки с фагом) не должны оказывать влияния на число формирующихся фагоустойчивых клеток. На всех чашках, как с посевами из отдельных пробирок, так и с посевами из одной пробирки, должно было бы вырасти примерно одинаковое количество устойчивых к фагу колоний, так как контакт с фагом был одинаков на всех чашках. Если же фагорезистентные мутанты возникают спонтанно, то в процессе размножения бактериальной популяции число мутантов в каждой пробирке должно было быть неодинаковым. Это должно быть связано с тем, что фагорезистентные мутанты возникают случайно относительно времени. В одних пробирках они могут возникать в начале роста культуры, в других позднее. В первом случае возникшие мутанты проделывают несколько циклов размножения, и к моменту высева из таких пробирок на чашки концентрация мутантов должна быть более высокой. Соответственно большим должно было быть и число фагорезистентных колоний, выросших на чашках. В других пробирках мутанты могут возникать позднее и к моменту высева они совершают лишь единичные деления, вследствие чего к моменту высева число их должно быть значительно меньшим. Меньшим должно было быть и число фагорезистентных колоний на этих чашках. В некоторых пробирках мутации могут совсем не совершаться. Фагорезистентные колонии при этом на чашках не обнаруживаются. Колебаний (флюктуации) в количестве фагорезистентных колоний на чашках при высеве из одной пробирки не должно наблюдаться, так как в данном случае высевается одна и та же суспензия клеток, содержащая определенную концентрацию мутантов, возникших до контакта с фагом.

С целью решения указанной задачи использовались различные приемы.
Лypua и Дельбрюк изучали в чувствительной к фагу культуре кишечной палочки появление устойчивых к нему клеток. Схематически их опыт представлен на 52. в ряд пробирок с равным количеством бульона (0,5 мл) эти авторы засевали одинаковое небольшое число клеток Е. coli (100 1000 бактерий). Одновременно той же концентрацией клеток засевали пробирку, содержащую 10 мл бульона. Низкая концентрация засева (100 1000 клеток) давала возможность исключить присутствие в культуре спонтанно сформировавшихся мутантов до посева, так как было известно, что фагорезистентные клетки в культуре, не обработанной мутагеном, встречаются с низкой частотой (1Ю7).
Через определенное время содержимое каждой пробирки высевали вместе с фагом на агаровые чашки. Одновременно производили равное количество аналогичных высевов из пробирки, содержащей 10 мл культуры тех же бактерий.