Микробиология, понятие микробиологии, статьи по микробиологии, микробиологические процессы

11.04.2011

Чем дальше мутация донора расположена от мутации, присущей реципиенту, тем более увеличивается протяженность фрагмента хромосомы донора, в пределах которого совершающиеся рекомбинации ведут к образованию прототрофов (49, 3).
Использование в перекрестных опытах трансдукиии ряда фенотипически однородных мутантов и анализ их относительно частоты образующихся трансдуктантов дают возможность судить о наличии определенных групп, которые относятся к различным генетическим единицам, контролирующим и им одного конечного метаболита. Окончательное заключение о наличии отдельных функциональных единиц (цистронов или генов) данного биохимического гут можно сделать в результате использования теста комплементации. Этот тест заключается в воспроизведении абортивной трансдукции у фенотипически однородных мутантов.
Как было указано выше, при абортивной трансдукции рекомбинаций не происходит привносимый фагом ген не интегрирует с хромой реципиента, а функционирует самостоятельно. Следовательно, при абортивной трансдукции не происходит рекомбинацпонного построения полноценного гена из двух идентичных генов, поврежденных в различных участках.

Как видно из 49, клетки реципиента несут мутацию в гене А. В качестве донора используются бактерии, мутировавшие по разным генам, входящим в данную группу сцепления. Так, если в опытах трансдукции донором и реципиентом служат идентичные мутанты, т. е. мутанты, несущие мутации в одной и той же точке одного и того же гена, то рекомбинанты по данному гену не образуются и рост прототрофов не наблюдается, так как интеграция поврежденного фрагмента не может восполнить дефект, присущий реципиенту (49, 1).
Если мутация возникла в пределах одного и того же гена, но в различных его участках, то при скрещивании таких мутантов трансдуктанты будут формироваться, однако частота их образования будет чрезвычайно мала. Это связано с тем, что эффективные рекомбинации, приводящие к формированию полноценного гена, могут происходить только при интеграции участка хромосомы донора, не содержащего мутации (49, 2).

Эти закономерности были установлены путем опытов трансдукции, в которых донорами и реципиентами служили фенотипически однородные мутанты, т. е. мутанты, зависимые по триптофану.
Понятно, что при наличии отдельных этапов (стадий) синтеза триптофана, являющегося конечным метаболитом, утрата способности его синтеза может быть связана с нарушением его образования в любой стадии. Следовательно, фенотипически однородные мутанты (неспособные синтезировать триптофан) могут нести мутации не только в одном и том же гене, но и в различных генах, контролирующих соответственные этапы синтеза триптофана.
При скрещивании путем трансдукции таких фенотипически однородных мутантов возможность формирования рекомбинантов прототрофов и их количество будут зависеть от того, какие гены повреждены у скрещиваемых мутантов.
Различные ситуации, возникающие при скрещивании фенотипически однородных мутантов, схематически изображены, из которого видно формирование рекомбинантов в группе сцепления четырех генов, условно обозначенных А, В, С, D.

Анализ рекомбинантов, получаемых в опытах конъюгации, позволяет выявить порядок расположения генов относительно друг друга, но не дает возможности точно установить расстояния отдельных генов друг от друга. Более точная локализация генов определяется с помощью трансдукции. При трансдукции передаются фрагменты хромосомы, не превышающие Vioo ее длины. Это позволяет использовать трансдукцию для генетического анализа соответственно небольших участков хромосомы, в частности для определения локализации генов, контролирующих отдельные звенья синтеза одного конечного метаболита, например триптофана, и для анализа тонкой структуры генов.
Конечный метаболит соединение, синтез которого осуществляется в несколько этапов, причем каждый из них состоит в образовании промежуточного продукта, который используется в последующей стадии синтеза.
Известно, например, что синтез триптофана осуществляется в несколько этапов. Сначала образуется антраниловая кислота, которая превращается в индолглицерофосфат; он служит источником для образования индола, а индол используется для синтеза конечного продукта триптофана. Перечисленные превращения происходят под влиянием ферментов, каждый из которых осуществляет один из этапов синтеза данного биохимическоо пути. В свою очередь генетические исследования показали, что каждый из этих этапов детерминируется определенными генами, число которых соответствует числу ферментов, участвующих в синтезе триптофана. Более того, стало очевидным, что расположение указанных генов соответствует последовательности этапов синтеза конечного метаболита.

Прерывая конъюгацию в различные интервалы времени и делая высевы на селективную среду, можно определить время вхождения в клетку реципиента различных генов. С этой целью используют штаммы с известной Оточкой, т. е. с известным участком хромосомы, первым поступающим в реципиентную клетку. Локализацию генов при этом выражают в единицах времени. Передача всей хромосомы обозначается 90 минутами, отдельные гены размещаются на карте в соответствии со временем их передачи (48).
Определение локализации генов при конъюгации по градиенту передачи маркеров. Данный метод основан на том, что частота приобретения рекомбинантами генов донора определяется их расстоянием от начальной точки передачи хромосомы. Отбор рекомбинантов ведут по маркеру, расположенному наиболее проксимально относительно Оточки хромосомы донора. Передача неселективных маркеров донора рекомбинантам, отобранным по селективному гену, выражается в процентах. О локализации генов относительно друг друга судят по проценту их передали. Так, в опытах со штаммом HfrH отбор может производиться по треониновому гену, проникающему первым в клетки реципиента. Если при этом приобретение рекомбииантами генов, определяющих резистентность к фагу Т1, способность ферментации лактозы, галактозы и резистентность к фагу Т6, соответственно составляет 70, 40, 35 и 25%, то порядок расположения генов должен быть следующим thr, Tl, lac, gal, Т6.