Микробиология, понятие микробиологии, статьи по микробиологии, микробиологические процессы

Апрель 2011

Показателем близости расположения генб. их сцепленностп служит процент их совместной передачи с геном, относительно которого производится селекция. Так, если в приведенном выше опыте среди 1гурекомбинантов 80% оказались gal+ и лишь 20% lys+, это означает, хт galген находится ближе к tryгену, чем lysген. О тесном сцеплении генов можно говорить в том случае, если совместная передача превышает 90%.
Данного рода анализ может характеризовать лишь близость либо отдаленность расположения генсЕ. но не определяет их порядок. Так, при 80% передаче galreHa и 20% передаче Iysгена совместно с tryгеном можно представить по крайней мере две вероятные последовательности расположения неселективных генов относительно триптофанового маркера a) try, gal, lys; б) gal, try, lys.
Определение локализации генов в единицах времени. Метод основан на том, что конъюгацию бактерпй можно прерывать, разрушая конъюгационный мостик. Для этого достаточно подвергнуть суспензию конъюгирующих бактерий резкому встряхиванию либо разведению.

В исследованиях по генетическому анализу чаще пользуются первым приемом, т. е. используют реципиента донора (Hfr).
Существует несколько способов определения локализации генов с помощью конъюгации.
Определение частоты совместной передачи генов. В данном случае устанавливается частота передачи различных генов совместно с геном, относительно которого производится селекция. Ген, в отношении которого ведется селекция, называется селективным маркером, а другие гены, которые не подвергаются селекции, неселективными. Например, при скрещивании донора прототрофа, ферментирующего галактозу (gal+) с реципиентом, зависимым по триптофану (try), не способным ферментировать галактозу (gal) и зависимым но лизину (lys), отбор можно вести по любому признаку, измененному у реципиента. Так, если вести отбор по триптофану, то в данном опыте триитофановый ген будет селективным маркером. Остальные маркеры (галактозный ген gal и лизиновый lys) будут неселективными. Чем ближе неселективный ген расположен к селективному, тем чаше они могут совместно включаться в хромосому клетки реципиента.

Схематически такая постановка опыта изображена на 47. Отбор рекомбинантов можно производить и другим методом, когда в качестве донора и реципиента используются штаммы, зависимые по разным аминокислотам. В этом случае к селективной среде не добавляют аминокислоты, необходимые донору, а также аминокислоту, необходимую реципиенту,, относительно которой ведется отбор рекомбинантов. Например, если реципиентом является штамм, зависимый по гистидину и метионину, то при отборе 1ту+рекомбинантов в селективной среде не должно быть триптофана, гистидина и метионина. На такой среде клетки донора не будут расти в результате отсутствия гистидина и метионина, а клетки реципиента не дадут роста вследствие отсутствия триптофана. Дадут рост рекомбинанты, которые приобрели способность синтеза триптофана от донора и сохранили способность синтеза гистидина и метионина, присущие реципиенту.

Несколько сложнее подобрать селективную среду при конъюгации, так как в этом случае при высеве бактерий после скрещивания вместе с рекомбинантами высеваются живые клетки и реципиента, и донора. Поэтому в качестве реципиента берут штамм, не только зависимый по данной аминокислоте, например, триптофану, но и резистентный к стрептомицину. Донором служит независимый но триптофану (ирототроф), но чувствительный к стрептомицину. Селективной средой в данном случае является глюкозо солевая среда, содержащая все аминокислоты, кроме одной, по которой ведется селекция (в данном случае триптофан). К селективной среде добавляется стрептомицин. Стрептомицин убивает клетки донора, а клетки реципиента не растут на такой среде из за отсутствия триптофана. Расти будут только рекомбинанты, которые сохранили стрептомицино устойчивость реципиента и приобрели способность синтеза триптофана за счет включения в хромосому реципиента try+ гена донора.

Для генетического анализа обычно отбирают рекомбинанты по одному признаку, например по приобретению способности синтеза какойлибо аминокислоты или по резистентности к антибиотикам. Этот признак называют селективным.
При любом способе скрещивания (конъюгации, трансдукции или трансформации) необходимо создание условий, обеспечивающих селекцию образующихся рекомбинантов. В случае трансдукции и трансформации это сделать относительно несложно, так как трансдуцирующий и трансформирующий факторы (фаголпзат и трансформирующая ДНК) не содержат живых бактерий. Для отбора рекомбинантов требуется подобрать среду, на которой не могут расти бактерииреципиенты, но способны давать рост рекомбинанты. Если например, реципиентом является штамм, неспособный синтезировать триптофан, а трансдуцирующий фаголизат получен из бактерий, синтезирующих эту аминокислоту, то селективной средой для отбора рекомбинантов должна быть среда, лишенная триптофана. На этой среде клетки реципиента не будут расти, а рекомбинанты, которые приобрели способность синтезировать триптофан, будут формировать колонии.